Trình tự sắp xếp các nucleotide (A, T, G, C) trong phân tử DNA đóng vai trò then chốt trong việc lưu trữ và biểu hiện thông tin di truyền, được ví như một "bản thiết kế" hay "mật mã" sinh học quy định sự hình thành và duy trì sự sống của sinh vật.
Dưới đây là các vai trò cụ thể của trình tự nucleotide:
Quy định mã di truyền: Thông tin di truyền được mã hóa dưới dạng các bộ ba nucleotide kế tiếp nhau, gọi là triplet trên DNA (tương ứng với codon trên mRNA). Mỗi bộ ba quy định một loại axit amin cụ thể trong chuỗi polypeptide.
Xác định cấu trúc protein: Trình tự nucleotide trong gene quy định trực tiếp trình tự sắp xếp của các axit amin trong protein. Trình tự axit amin (cấu trúc bậc 1) lại quyết định cách cuộn gập không gian và chức năng sinh học cuối cùng của protein đó.
Tạo nên tính đa dạng và đặc thù: Chỉ với 4 loại nucleotide, nhưng sự thay đổi về số lượng, thành phần và đặc biệt là trình tự sắp xếp đã tạo nên vô số các phân tử DNA khác nhau. Đây là cơ sở cho sự đa dạng giữa các loài và tính đặc thù của từng cá thể (ngoại trừ sinh đôi cùng trứng).
Chứa các tín hiệu điều hòa: Trình tự nucleotide không chỉ mã hóa protein mà còn chứa các đoạn mang tín hiệu điều khiển hoạt động của gene, như vùng khởi động (promoter) để bắt đầu phiên mã hoặc các vùng báo hiệu kết thúc.
Bảo vệ thông tin di truyền: Một số trình tự nucleotide đặc biệt nằm ở đầu mút nhiễm sắc thể (telomere) giúp bảo vệ các nhiễm sắc thể không bị dính vào nhau và duy trì tính ổn định của bộ máy di truyền qua các lần phân bào. 
Sự thay đổi trong trình tự sắp xếp các nucleotide (do đột biến như thay thế, thêm hoặc mất nucleotide) có thể làm thay đổi thông tin di truyền, dẫn đến biến đổi cấu trúc protein và có khả năng gây ra các bệnh di truyền hoặc tạo ra các biến dị mới.